Son travail se base principalement sur la clarté, la logique et l’ordre, et favorise la ligne sur la couleur. Son travail est une alternative au style baroque, dominant au 17e siècle. Jusqu’au 20e siècle, il est demeuré la source d’inspiration principale pour les artistes orientés vers le classicisme tels que Jacques-Louis David, Paul Cézanne et Jean-Auguste-Dominique Ingres. Il a passé la majeure partie de sa vie à Rome, à l’exception d’une courte période où le cardinal de Richelieu lui a ordonné de revenir en France pour servir de premier peintre du Roi.
Le premier biographe de Nicolas Poussin est son ami Giovanni Pietro Bellori, qui rapporte que Poussin est né près de Les Andelys en Normandie et qu’il a reçu une éducation qui comprend un peu de latin, ce qui lui est très utile.
Les premières esquisses de Poussin attirent l’attention de Quentin Varin, un peintre local, dont Poussin sera l’élève jusqu’à ce qu’il s’enfuisse à Paris à l’âge de 18 ans. À ce moment, Il entre dans les studios du peintre flamand Ferdinand Elle, puis de Georges Lallemand, deux petits maîtres désormais connus pour avoir instruit Poussin. Il trouve l’art français dans une phase de transition : l’ancien apprentissage est troublé et la formation académique destinée à le supplanter n’est pas encore établie — elle le sera plus tard, par Simon Vouet.
Poussin a 30 ans quand il arrive à Rome, en 1624. Dans un premier temps, il loge avec Simon Vouet. Grâce à Marin, il est présenté à Marcello Sacchetti, qui à son tour lui fait découvrir un autre de ses clients, le cardinal Francesco Barberini.
Les difficultés financières de Poussin commencent avec le départ pour l’Espagne de Barberini, accompagné de Cassiano dal Pozzo, l’antiquaire et le secrétaire du cardinal, qui plus tard deviendra un grand ami et mécène de l’artiste. Cependant, leur retour d’Espagne, en 1626, stabilise la position de Poussin, avec le patronage renouvelé de Barberini et de son entourage.
Il tombe malade à ce moment et est reçu dans la maison de son compatriote Jacques Dughet, où il est soigné par la fille de Dughet, Anna Maria, qu’il épouse en 1630.
Ses deux beaux-frères sont des artistes et Gaspard Dughet prendra plus tard le nom de Poussin.
Louis XIII lui confère le titre de premier peintre du Roi et de directeur général des embellissements des maisons royales. En 2 ans à Paris, Poussin produit plusieurs peintures pour les chapelles royales.
En 1642, dégoûté par les intrigues de Simon Vouet, de Fouquières et de l’architecte Jacques Lemercier, Poussin se retire à Rome. D’année en année, il continue à produire une grande variété d’œuvres, dont la plupart sont inclues dans la liste donnée par Félibien.
Sa santé commence à décliner après 1650 et il est troublé par un tremblement dans sa main, ce qui est évident dans ses dessins tardifs. Il est décédé à Rome le 19 novembre 1665 et est enterré dans l’église de San Lorenzo à Lucina, sa femme l’ayant précédé dans la tombe.
Poussin ne laissa pas d’enfants, mais il adopta comme fils Gaspard Dughet (Gasparo Duche), frère de sa femme, qui devint peintre et prit le nom de Poussin.